Die Sequenzierung hat die biologischen und medizinischen Wissenschaften auf revolutionäre Weise vorangetrieben und das Zeitalter der Genomik eingeleitet. Was die klinische Medizin betrifft, wird die Sequenzierung zunehmend als analytische Schlüsselmethode zur Untersuchung genetisch bedingter Erkrankungen, krebsbedingte Zellveränderung oder Eigenschaften von Krankheitserregern herangezogen und ist aus einem molekularbiologischen, diagnostischen Laborbetrieb nicht mehr wegzudenken. Die Weiterentwicklung der herkömmlichen Methode nach Sanger der letzten vierzig Jahre führte in jüngster Zeit zu modernen Verfahren, die durch beschleunigte Sequenzierung anhand eines hochparallelen Einsatzes eine erhebliche Verbesserung herbeiführen. Diese zeitlich nach der Sanger-Methode entwickelten Verfahren der Hochdurchsatz-Sequenzierung werden unter dem Begriff Next Generation Sequencing (NGS) oder Massive Parallel Sequencing oder Deep Sequencing zusammengefasst. (1)
Next Generation Sequencing
DNA-Sequenzierung ist eine Methode für die Bestimmung der Abfolge der Nukleotide in einem DNA-Strang.
Hohe Kapazität der NGS
Die Realisierung der massiven parallelen Sequenzierung von Millionen DNA-Fragmenten in einem einzigen Sequenzierlauf ermöglichen die Erzeugung von Sequenzdaten bis zu einigen Gigabasen. NGS ist durch den hohen Durchsatz deutlich kostengünstiger, schneller und qualitativ bei entsprechender Expertise der konventionellen Sanger-Sequenzierung überlegen, insbesondere auch bezüglich komplexer Genveränderungen wie z.B. Deletionen oder Duplikationen. (2) Die möglichen Anwendungen gehen noch weit über diese erwähnten Beispiele hinaus.
Sequenziertiefe der NGS
Neben der hohen Sequenzierkapazität, findet bei NGS darüber hinaus eine klonale Amplifikation einzelner mit Barcodes versehenden Moleküle statt. Bei der klassischen Sequenzierung nach Sanger hingegen werden Moleküle simultan, also nicht einzeln amplifiziert. Der Nachweis von Minoritäten spielt in der Tumordiagnostik eine wesentliche Rolle: Gerade in der molekularen Onkologie trifft man oft auf Mutationen mit mosaikartiger Verteilung im Gewebe oder auf geringe Materialmenge, wie z.B. bei Biopsien, oder auf Therapieverläufe, bei denen eine minimale Resterkrankung nachgewiesen werden soll. Durch die hohe Sequenziertiefe kann mit NGS hier noch eine Aussage bezüglich der relevanten Genveränderungen getroffen werden. Das kann auch der Fall sein, wenn der Anteil von Zellen, welche nicht von der Genveränderung betroffen sind, relativ hoch ist.
In der NGS -Routinediagnostik liegt unser Fokus auf der Companion Diagnostik der Entitäten NSCLC, CRC, Mamma, Melanom und GIST. Des Weiteren werden im Rahmen der in-vitro Diagnostik tumorgenetischer Veränderungen Prostata-, Endometrium-, Schilddrüsenkarzinome, Gallengangskarzinome und Pankreaskarzinome sowie andere seltene Entitäten untersucht. Alle Fusionen werden mittels Amplikon-basierten NGS Methoden detektiert und ggf. mittels FiSH überprüft.
(1) Metzker ML. Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet. 2010, 11:31-46.
(2) Frampton GM et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 2013, 31: 1023-1031.